Suolistomikrobiston profiloinnista uusi työkalu hevosten tulehduksellisten suolistosairauksien tunnistamiseen

Tietoisuus tulehduksellisista suolistosairauksista (IBD) ihmisellä ja muilla ihmisen muokkaamassa ympäristössä elävillä lajeilla on kasvanut merkittävästi viime vuosikymmeninä. Hevosten tulehdukselliset suolistosairaudet (IBD) tunnistetaan nykyään vakavana hevosten hyvinvointia uhkaavana tekijänä. Ne aiheuttavat paitsi laihtumista, ripulia ja muita vatsaoireita, myös yleisoireita kuten suorituskyvyn heikkenemistä ja kipukäyttäytymistä. Vaikka hoitokeinojen kehittymisen myötä selviämisennuste on parantunut, on se edelleen vain kohtalainen. IBD:n diagnosointi on kallista ja stressaavaa hevosille, sillä se vaatii yleensä kuljetuksen klinikalle, paaston, tähystyksen ja koepalojen oton. Hevosen pitkän suoliston takia koepaloilla voidaan kuitenkin käytännössä tutkia vain pieni osuus koko suolistosta, ja näin ollen diagnoosi jää usein yleiseen oirekuvaan perustuvaksi. Siksi on tarvetta kehittää uusia, vähemmän invasiivisia ja edullisempia diagnostisia työkaluja.

Äskettäin julkaisemassamme artikkelissa (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39199930/) me FINEBIOME-tutkimusryhmäläiset esittelemme lupaavaa uutta vaihtoehtoista kartoitus- ja diagnoosityökalua, joka perustuu suolistomikrobiston lajiston selvittämiseen hevosen lantanäytteestä. Esimerkiksi ihmisellä, kissalla ja koiralla suolistomikrobiston koostumuksen muutos on luotettava mittari suolistotulehdukselle ja sen avulla onkin suolistotulehdus pystytty havaitsemaan yli 90 % varmuudella. Tutkimuksemme osoittaa, että myös lantanäytteestä saatua hevosten suolistomikrobistoa voidaan käyttää suolistotulehduksen indikaattorina.

Jokaisen hevosen suoliston mikrobilajisto on yksilöllinen. Mikrobisto koostuu pieneliöistä kuten bakteereista, viruksista ja sienistä. Tutkimuksessa havainnoimme eri bakteerilajeja ja lajien runsauksia tutkimukseen osallistuneilla hevosyksilöillä. Käytimme hevosen suolistobakteerien erästä tiettyä DNA-aluetta, ribosomin 16S-alayksikköä.  Tämä DNA-alue mikrobien perimässä on suosittu mikrobilajien tunnistukseen käytetty alue, sillä se on sopivan vaihteleva bakteerilajien välillä. Eristämällä bakteereista 16S-alayksiköstä noin 470 emäksen mittaisen DNA-alueen, pystyimme havainnoimaan lantanäytteiden bakteereja usein jopa lajitasolla. Selvittääksemme bakteerien 16S-alueiden sekvenssit, sekvensoimme lantanäytteistä eristämämme DNA-alueet eli muutimme DNA-molekyylit digitaaliseen muotoon Jyväskylän yliopiston Illumina MiSeq-sekvensointilaitteella.

Kuva 1. Tutkimuksessa havainnoimme hevosyksilöiden lannasta havaittujen bakteerien (A) lajiston. Eristimme lannassa elävien bakteerien DNA:t ja niistä 16S-alayksikköön kuuluvan 470 emäsyksikön pituiset osat (B), joiden perusteella bakteerit voi identifioida lähes lajilleen. Näin pystyimme laatimaan hevoskohtaiset suoliston mikrobistoprofiilit (C).

Tutkimukseen osallistui 27 tervettä ja 49 IBD:tä sairastavaa hevosta. Osan näytteistä toimittivat ahkerat vapaaehtoiset hevosenomistajat, jotka halusivat edistää hevosen IBD:n tutkimusta. Osan näytteistä toimitti Laukaan hevosklinikka.

Tuloksemme osoittivat, että tietyt bakteeriryhmät olivat lisääntyneet ja toiset ryhmät vähentyneet IBD-hevosilla. Yksittäisien lajien ja lajiryhmien muutokset olivat kuitenkin vain viitteellisiä, eli emme löytäneet yhtään yksittäistä mikrobia tai laajempaa taksonomista ryhmää, jonka runsastuminen tai vähentyminen olisi yksinään vahvasti liittynyt IBD:hen. Yksittäiset bakteerilajit tai -ryhmät eivät siis toimineet IBD:n indikaattorina.

Yhdistimme eri mikrobilajien runsaudet ja opetimme niiden avulla keinotekoisen hermoverkko -koneoppimismallin ennustamaan hevosten terveydentilan. Käytimme mallin opettamiseen 80 % tutkimukseen käytetyistä hevosista. Mallin toimivuuden arvioimiseksi on tärkeää käyttää myös sille ennalta tuntemattomia näytteitä testijoukkona, sillä malli lajittelee sille opetusvaiheessa esitellyt hevoset niihin ryhmiin, jotka on sille kerrottu. Siksi jätimme 20 % hevosista esittelemättä mallille sen opetusvaiheessa. Valmis malli osasi ennustaa IBD:n näistä 20 % sille uudesta hevosesta 100 % tarkkuudella. Tämä viittaa siihen, että tulevaisuudessa suolistomikrobiston tutkiminen lantanäytteistä voisi olla tarkka, edullinen ja ei-invasiivinen menetelmä hevosten IBD:n seulontaan.

Kuva 2. Keinotekoisen hemoverkkomallin tulokset. Mustat ympyrät ovat hevosia, jotka oli ilmoitettu terveiksi ja punaiset ympyrät hevosia, joilla oli ilmoitettu olevan IBD. Vaaka-akselilla on IBD-indeksi, joka kertoo mallin ennusteen hevosen terveydentilasta. Nollaa lähenevä indeksi kertoo, että malli ennustaa hevosen olevan terve, ja yhtä lähenevä indeksi sitä, että malli ennustaa sen sairastavan IBD:tä. Avoimet ympyrät ovat mallin opettamisessa käytettyjä hevosia, joiden terveydentila kerrottiin mallille sitä opetettaessa. Siksi kaikki mallille opetusvaiheessa esitellyt hevoset saivat hyvin merkittävät ennusteet. Kiinnostavia mallin toiminnan arvioimisen kannalta ovat mallille ennalta esittelemättä jätetyt nk. testiryhmän hevoset (suljetut ympyrät). Koska jokaisen hevosen suolistomikrobisto on uniikki, testiryhmän hevosten IBD-indeksit eivät ole yhtä ääreviä kuin mallin ennalta tuntemien hevosten indeksit. Mallimme osasi kuitenkin ennustaa jokaisen testiryhmän hevosen terveydentilan oikein.

Tutkimme myös toisen muilla lajeilla toimivan biomarkkerin, kalprotektiinin, potentiaalia IBD:n biomarkkerina hevosella. Kalprotektiini on valkosolujen proteiini, jota ne tuottavat erityisesti tulehdusreaktion aikana. Olimme yllättyneitä siitä, että kalprotektiinipitoisuus ei meidän näytteissämme ollut IBD-hevosilla koholla.

Työmme ei vielä ole tehty, sillä toimiakseen luotettavana mittarina IBD:n seulonnassa, on koneoppimismallia kehitettävä lisää ja testattava vielä isommalla näytemäärällä. Haluamme arvioida esimerkiksi, kuinka paljon laboratoriotöiden aiheuttama vaihtelu vaikuttaa mallin ennusteisiin, pystyykö malli erottelemaan IBD:n myös näytteistä, jotka on kerätty eri vuosina ja erottaako malli IBD:n muista suolistosairauksista, kuten ärtyvästä suolesta tai ripulista.

Tutkimuksemme avaa uusia mahdollisuuksia hevosten terveydenhuollossa ja korostaa suolistomikrobiston potentiaalia sairauksien diagnosoinnissa ja hoidossa. Suolistomikrobiston profilointi voisi tulevaisuudessa auttaa eläinlääkäreitä päättelemään, lähdetäänkö ensisijaisesti hevoselta etsimään suolistosairautta vai muita ongelmia. Näin resursseja voitaisiin kohdentaa tehokkaasti. IBD:n tunnistaminen varhaisessa vaiheessa mahdollistaisi nopeamman ja tehokkaamman hoidon, ja toisaalta taas välittömän huomion kohdentaminen liikunta- ja tukielimistöön voi joissain tapauksissa olla hevosen hyvinvoinnin kannalta ensiarvoista.